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          elisa標準品的制備鑒定與計量方法

          更新時間:2023-07-25      瀏覽次數:364

           一、標準品的制備


            標準品的制備是非常復雜的問題,也是標記免疫分析中比較難于制備的一個成分。以下討論的是實驗室標準品(或商品化試劑中標準品)的制備。


           ?。?)基質的制備:如前所述,作為標準品的介質(基質)成分應與被測樣品相同。對大多數用于測定血清中某物質的標準品,應用不含被測物質的零血清制備,以求反應的介質環境相當。但有時零值血清的制備十分困難,所以有些標準品用適當的緩沖液制備,并在緩沖液中加入一定量的載體蛋白(一般用1%~2%的牛血清白蛋白),以便使其與樣品的介質環境相近。


            零值血清的制備方法有:


            A、吸附法:血清中小分子物質如三碘甲狀腺原氨酸 (T3)、甲狀腺素(T4)等,可用活性炭吸附去除。這種方法簡便,但待測物質難以清除干凈,而且大分子活性物質不能用此法進行制備。


            B、反復凍融法:對大分子活性物質可選用低值血清,經反復凍融使被測物質失活。用這種方法可使某些蛋白類激素大部分失活,但也難以得到真正的零值血清。


            C、親和層析法:用特異性抗體制備親和層析柱,用以吸附被測抗原。用這種方法可以得到高質量的零值血清,但本法比較復雜而且成本也高。


           ?。?)標準物純品的選擇:應選擇高化學純和高免疫純的純品作標準品。其中免疫純尤為重要,在標準品中不應含有與被測物質有交叉反應的物質。


           ?。?)標準品的制備:先用零值血清配置高濃度的標準品,然后根據實驗系統的要求,用零值血清將高值血清稀釋至應有的濃度,制成符合預定要求的,由不同濃度組成的系列標準品。

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            二、標準品的鑒定


           ?。?)免疫活性的鑒定:選用高特異性的抗血清分別作公ren標準品(如WHO的國際參考品或國家標準品)的待鑒定標準品的劑量反應曲線,并觀察兩條曲線的平行性。如兩條劑量反應曲線平行,說明兩種物質對同一抗體有相同的親和力,即二者是同質性物質。如兩條劑量反應曲線不平行,說明兩種物質具有異質性,因而這一待鑒定的標準品是不能使用的。


           ?。?)濃度的標定:用已鑒定過的,免疫活性合格的標準品,與公ren的標準品作濃度相同的劑量反應曲線。此時,兩條劑量反應曲線應該是基本重合的。如果兩者平行但不重合,則取兩條劑量反應曲線的50%結合處的相應劑量( ED50 )計算二者的換算系數,然后調整待鑒定標準品的濃度,直至使兩條劑量反應曲線wan全或基本重合為止。


            三、標準品的計量



            許多小分子抗原或半抗原已能得到純品或進行合成,它們對作為標準品的要求可以得到基本的滿足,其計量多直接用單位體積中的重量表示,如mg / ml、ng / ml 、pg / ml等。最近WHO推薦用質量單位取代重量單位,即mol / L、mmol / L、或nmol / L等。對大分子的活性物質則比較復雜。由于得不到絕對的純品,故很難直接用單位體積中的重量或單位體積中的質量計量。因此,常用該物質的生物活性單位表示,如IU / L、mIU / L等。


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