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          細菌 環二鳥苷酸(c-di-GMP)ELISA試劑盒處理及保存方法

          更新時間:2023-04-04      瀏覽次數:331

                                                   細菌Bacteria環二鳥苷酸(c-di-GMP)ELISA檢測試劑盒
          檢測原理
          試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗ELISA)。往預先包被環二鳥苷酸(c-di-GMP)抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經過溫育并全部洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的環二鳥苷酸(c-di-GMP)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。
          樣品收集、處理及保存方法
          1.  血清:使用不含熱原和內毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
          2.  血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。
          3.  細胞上清液:3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
          4.  組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘
          取上清。
          5.  保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
          自備物品

          1. 酶標儀(450nm)

          2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

          3. 37℃恒溫箱

          操作注意事項

          1.   試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶,這屬于正?,F象,水浴加熱使結晶全部溶解后再使用。

          2.   實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

          3.   濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白;按照說明書操作時樣本已經稀釋5倍,最終結果乘以5才是樣本實際濃度。

          4.   嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

          5.   所有液體組分使用前充分搖勻。注:標準品(S0-S5)濃度依次為:0、100、200、400、800、1600 ng/mL
            試劑的準備
             20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
            洗板方法

          6.   手工洗板:甩盡孔內液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。

          7.   自動洗板機:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。

          8. 操作步驟

          9.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

          10.   設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;

          11.   樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。

          12.   除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

          13.   棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。

          14.   每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

          15.   每孔加入終止液50μL,15min內,在450nm波長處測定各孔的OD值。

          16. 結果判斷
             繪制標準曲線:在Excel工作表中,以標準品濃度作橫坐標,對應OD值作縱坐標,繪制出標準品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。

          17. 試劑盒性能

          18.  準確性:標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值,大于等于0.9900。

          19.  靈敏度:最少檢測濃度小于1.0 ng/mL。

          20.  特異性:不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

          21.  重復性:板內、板間變異系數均小于15%。

          22.  貯藏:2-8℃,避光防潮保存。

          23.  有效期:6個月

          24. 免責聲明
              試劑盒僅供研究使用,不得用于臨床實驗或細菌體實驗,否則所產生的一切后果,由實驗者承擔,本公司概不負責。

          25.   嚴格按照說明書操作,實驗者違反說明書操作,后果由實驗者承擔。


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